中美歐三國監(jiān)管機(jī)構(gòu)對于復(fù)制型病毒的控制階段和檢測要求基本相同，在產(chǎn)品生產(chǎn)的各個階段以及在接受基于病毒載體的基因治療的患者后續(xù)監(jiān)測中進(jìn)行檢測。并且各監(jiān)管機(jī)構(gòu)推薦的復(fù)制型病毒的檢測方法均是指示細(xì)胞培養(yǎng)法，該方法是復(fù)制型病毒檢測的金標(biāo)準(zhǔn)。

在重組腺相關(guān)病毒(rAAV)載體生產(chǎn)過程中，轉(zhuǎn)染用質(zhì)粒DNA與rAAV會由于物理接近而導(dǎo)致rAAV載體基因組、Rep/Cap基因以及ITR序列發(fā)生非同源重組，這些重組序列被誤包后就形成了具有復(fù)制能力的AAV，即復(fù)制型腺相關(guān)病毒(rcAAV)。

目前，rcAAV檢測常采用2種方法：基于細(xì)胞培養(yǎng)的檢測方法和qPCR快檢法（直接檢測法）。

FDA的指導(dǎo)原則建議通過全面的質(zhì)量研究確認(rèn)產(chǎn)品的關(guān)鍵質(zhì)量屬性，由于下述rcAAV的兩種檢測方法各有優(yōu)缺點，可考慮同時采用原理互補(bǔ)的不同方法進(jìn)行研究。

• 基于細(xì)胞培養(yǎng)的檢測方法

通過不斷的細(xì)胞傳代使rcAAV實現(xiàn)擴(kuò)增，之后再利用qPCR或Southern-blot方法進(jìn)行檢測，保證檢測到的rcAAV都具有復(fù)制能力，是目前最常用的檢測方法。

但是該方法也有它的缺陷：檢測靈敏度依賴于AAV不同血清型對靶細(xì)胞的感染效率，檢測值可能低于實際值；培養(yǎng)方法和檢測平臺建立也有難度，需建易感細(xì)胞株、輔助病毒庫等，耗時長且投入成本較高。

• qPCR快檢法（直接檢測法）

對rAAV原液或終產(chǎn)品提取核酸后，直接利用qPCR法檢測rcAAV，靶標(biāo)基因一般為ITR、Rep、Cap等的連接序列，可實現(xiàn)對rcAAV上兩種基因的檢測，提高準(zhǔn)確性。

其缺點為：檢測片段短，不能保證檢測目標(biāo)具備rcAAV復(fù)制所需完整序列，導(dǎo)致檢出的rcAAV不一定有復(fù)制能力，檢測值相較實際值偏高。

因此，針對rcAAV的檢測開發(fā)一款既能用于細(xì)胞培養(yǎng)后的終點檢測，也能用于rcAAV直接檢測的qPCR試劑盒，對于實現(xiàn)兩種檢測方法的互補(bǔ)驗證非常有必要。

針對上述情況，翌圣生物自主研發(fā)了復(fù)制型腺相關(guān)病毒血清型2 (rcAAV2)檢測試劑盒，基于熒光探針定量PCR原理，采用qPCR法分別檢測rAAV末端重復(fù)序列(ITR)（即參考基因Reference）和rcAAV的連接序列（即靶基因Target），實現(xiàn)對rAAV和rcAAV的同時定量檢測。還研發(fā)了與之配套使用的宿主細(xì)胞殘留DNA樣本前處理試劑盒，以及配套的自動化核酸提取儀器。用于定量分析檢測各種使用AAV2血清型的重組腺相關(guān)病毒載體進(jìn)行基因治療、腫瘤治療及疫苗研發(fā)等產(chǎn)品中可能發(fā)生的復(fù)制型腺相關(guān)病毒(rcAAV)的潛在風(fēng)險。

產(chǎn)品資質(zhì)：  

符合法規(guī)：按照EP2.6.7、JP G3和USP 63藥典要求驗證，符合國際權(quán)威機(jī)構(gòu)的標(biāo)準(zhǔn)；

配合審計：產(chǎn)品生產(chǎn)符合ISO13485質(zhì)量體系標(biāo)準(zhǔn)，有完善的審計文件；

保障品質(zhì)：試劑盒所需酶原料全自產(chǎn)，且已產(chǎn)業(yè)化，供貨穩(wěn)定；

技術(shù)經(jīng)驗積累：TaqMan法有技術(shù)沉淀，使得Kit靈敏度高；

專注產(chǎn)品性能：Taq酶抗體庫，雙封閉抗體提高了Kit特異性、穩(wěn)定性等。

產(chǎn)品特點：

抗干擾性：針對復(fù)雜基質(zhì)，樣本加標(biāo)回收率至少能達(dá)到70-130%；

靈敏度高：定量下限(LLOQ)為2copies/μL，檢測下限(LLOD)為0.125copies/μL；

精密度高：批內(nèi)重復(fù)性高CV＜10%，批間差異小即中間精密度CV＜15%；

專屬性強(qiáng)：特異性檢測目的基因序列，不受其他外源基因組DNA干擾；

防干擾強(qiáng)：引入內(nèi)部質(zhì)控(IC)，可排除樣本干擾、反應(yīng)配制異常等，避免假陰性。

驗證完善：參考ICH Q2（R2）分析方法驗證指導(dǎo)原則，可提供完善的驗證報告。

驗證內(nèi)容：

產(chǎn)品信息：